Применение     метода     соматической     гибридизации     для     изучения     процессов дифференцировки и для генетического картирования. Химерные (аллофенные) животные.

 


Методы клеточной инженерии позволяют объединять различные типы клеток. Слияние клеток, принадлежащих к разным биологическим видам, называется соматической гибридизацией. Сущность соматической гибридизации заключается в получении синтетических культур путем слияния протопластов различных видов организмов. Для слияния клеток используют различные физические и химические методы. После слияния протопластов образуются многоядерные гетерокариотические клетки. В дальнейшем при слиянии ядер образуются синкариотические клетки, содержащие в ядрах хромосомные наборы разных организмов. При слиянии антителообразующих клеток (например, В–лимфоцитов человека) и раковых клеток (например, клеток миеломы мышей) образуются гибридомы. Это клеточные гибриды, сохраняющие свойства лимфоцитов (способность к образованию строго определенных антител) и свойства раковых клеток (способность к неограниченному числу делений). Гибридомы вырабатывают однородные антитела, взаимодействующие со строго определенными возбудителями заболеваний или другими антигенами. Такие антитела называют моноклональными.

Эмбриональные стволовые клетки - ЭСК являются идеальной системой для направленного переноса мутаций в геном млекопитающих.

Первичные культуры этих клеток получают из клеток бластоцисты (внутренней клеточной массы) или из первичных половых клеток ранних постимплантационных зародышей. При выращивании на питательном слое из эмбриональных фибробластов ЭСК сохраняются в недифференцированном состоянии от 3 мес. до 1 года. При этом они могут быть несколько раз заморожены и оттаяны без потери способности к дифференцировке. ЭСК, введенные в бластоцель (полость бластоцисты), сохраняют свою тотипотентность и могут участвовать в формировании практически всех эмбриональных зачатков и органов развивающегося зародыша. В результате образуется животное - химера - состоящее из клеточных клонов двух разных типов: клеток исходного родительского генотипа и ЭСК. Если эти клетки различаются, например, по генам окраски шерсти, животное-химера - будет иметь поперечную или пятнистую окрашенность. При этом все животные, независимым образом полученные в результате введения в одинаковые по генотипу зародыши одной и той же линии клеток, будут отличаться друг от друга по характеру пятнистости, так как все химеры различны по набору клеточных клонов, развившихся и дифференцировавшихся из введенных в зародыш ЭСК. Химерные животные, у которых ЭСК дифференцировались в половые клетки и дали начало полноценным зрелым гаметам, будут устойчиво передавать своим потомкам генетическую информацию, содержащуюся в ЭСК. Таких животных иногда называют зародышевыми трансмиттерами . При скрещивании их с мышами дикого типа часть потомков будут уже гетерозиготны по мутантным генам ЭСК, т. е. будут нести мутацию в гаплоидном состоянии в каждом типе клеток. Это в равной степени относится и к мутациям, предварительно искусственно введенным в ЭСК. Скрещивая такие гетерозиготы, можно получить животных, гомозиготных по заданной мутации. Естественно, последнее достижимо только в том случае, если мутация не окажется летальной в гомозиготном состоянии у животных этого вида.

 Методы создания химер

1. Агрегационный - был предложен практически одновременно и независимо друг от друга Тарковским в Варшаве и Минц в Филадельфии (1961-1962 гг.).

Из матки беременных самок-докторов извлекают зародыши, достигшие стадии 8 бластомеров. Бластомеры, полученные от двух животных с различными генотипами (например, от мышей с белой черной окраской шерсти) помещают в условия, способствующие их агрегации и образованию 16-ти клеточного зародыша. Такие составные зародыши развиваются in vitro до стадии бластоцисты, после чего их вводят в матку приемной матери, у которой предварительно вызывают ложную беременность путем введения соответствующих гормонов. В результате получаются аллофенные мышата. Когда у мышонка появляется шерсть, окраска у него оказывается не белой или черной, как у родителей, а смешанной, с чередующимися черными и белыми пятнами или полосами. Это доказывает, что ткани животных-химер мозаичны, т.е. состоят из белых и черных клеток.

Внутренние ткани таких животных, естественно, также мозаичны, хотя это проявляется не так очевидно, как в случае окраски шерсти. Различия могут касаться белков, выполняющих ферментативную функцию: они могут катализировать одни и те же реакции у мышей-родителей, нуждаться в одних и тех же кофакторах, но при этом быть не идентичными, хотя и сходными. Такие белки называются изоферментами, и их можно разделить с помощью электрофореза. Агрегационные химеры можно получать не только между двумя эмбрионами, но и между различным числом изолированных бластомеров или отдельными частями эмбрионов. Масса химерных эмбрионов не больше обычной и подвержена действию механизмов эмбриональной регуляции. Преимущество метода - не требует вмешательства микрохирургической техники, поэтому широко используется в эмбриогенетике.

2. Инъекционный - был разработан Р. Гарднером в 1968 г.

Используются эмбрионы на стадии бластоцисты. Бластоцисту фиксируют и, используя микроманипуляторы, вводят путем инъекции клетки внутриклеточной массы бластоцисты доноров в бластоцель эмбриона - рецепиента. Этим методом можно инъецировать не только внутриклеточную массу ранних эмбрионов, но и более дифференцированные клетки.

Инъекционный метод нашел применение при получении межвидовых химер. Первые межвидовые химеры были получены между двумя ближайшими видами мышей, которые обычно не скрещиваются: M. muskulus и M. caroli. Причем было отмечено, что химерные эмбрионы, полученные инъекционным методом, нормально развивались только при пересадке их в матку того вида, чья бластоциста была использована в качестве рецепиента. Например, в бластоцисту M. muskulus вводили внутриклеточную массу эмбриона M. caroli. Полученные химеры имплантировались в матку M. muskulus и благополучно развивались там, а в организме M. caroli погибали спустя две недели.


Предыдущие материалы: Следующие материалы: