Понятие о векторах. Векторы на основе плазмид и ДНК фагов. Геномные библиотеки. Способы получения рекомбинантных молекул ДНК, методы клонирования генов.

 


Строение рекомбинантной ДНК.  Гибридная  ДНК  имеет  вид  кольца.  Онасодержит ген (или гены) и вектор. Вектор - это фрагмент ДНК,  обеспечивающий размножение  гибридной  ДНК  и  синтез   конечных   продуктов   деятельности генетической системы - белков. Большая часть  векторов  получена  на  основе фага лямбда, из плазмид, вирусов SV40,  полиомы,  дрожжей  и  др.  бактерий.

Синтез белков происходит клетке-хозяине. Наиболее часто в  качестве  клетки-хозяина используют  кишечную  палочку,  однако  применяют  и  др.  бактерии, дрожжи, животные или растительные клетки.  Система  вектор-хозяин  не  может быть  произвольной:  вектор  подгоняется  к  клетке-хозяину.  Выбор  вектора зависит от видовой специфичности и целей исследования. Ключевое  значение  в конструировании гибридной ДНК несут два фермента.  Первый  -  рестриктаза  - рассекает молекулу ДНК на фрагменты по строго определенным местам. И  второй  - ДНК-лигазы - сшивают фрагменты ДНК в единое целое. Только после  выделениятаких  ферментов  создание   искусственных   генетических   структур   стало технически выполнимой задачей.

Этапы генного  синтеза.  Гены,  подлежащие  клонированию,  могут  быть получены  в  составе  фрагментов  путем  механического  или   рестриктазного дробления тотальной ДНК. Но структурные гены, как правило,  приходится  либо синтезировать химико-биологическим путем, либо  получать  в  виде  ДНК-копии информационных  РНК,  соответствующих  избранному  гену.  Структурные   гены содержат только кодированную  запись  конечного  продукта  (белка,  РНК),  и полностью   лишены   регуляторных   участков.   И   поэтому   не    способны функционировать в клетке-хозяине.

При получении рекДНК образуется  чаще  всего  несколько  структур,  из которых только одна является нужной. Поэтому  обязательный  этап  составляет селекция и молекулярное клонирование рекДНК, введенной  путем  трансформации в  клетку-хозяина.  Существует  3  пути   селекции   рекДНК:   генетический, иммунохимический и гибризационный с мечеными ДНК и РНК.

Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.

Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.

Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Следует отметить, что из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.
Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же рестриктазой, добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК, которую вводят в бактериальные или дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с образованием многих копий. Многие плазмиды несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком.
Каждая такая колония представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.

Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных, т.е. содержащих чужеродный ген, плазмид. Плазмиды представляют собой кольцевые двухцепочные молекулы ДНК, состоящие из нескольких тысяч пар нуклеотидов. Этот процесс состоит из нескольких этапов.

1.Рестрикция - разрезание ДНК,например,человека на фрагменты.

2. Лигирование - фрагмент с нужным геном включают в плазмиды и сшивают их.

3. Трансформация - введение рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки. Трансформированные бактерии при этом приобретают определенные свойства. Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков - клон

4. Скрининг - отбор среди клонов трансформированных бактерий тех, которые плазмиды, несущие нужный ген человека.

Весь этот процесс называется клонированием.


Предыдущие материалы: Следующие материалы: