Получение с помощью генетической инженерии трансгенных организмов.  Основы генетической    инженерии    растений    и    животных:    трансформация    клеток    высших организмов, введение генов в зародышевые и соматические клетки животных.

 


Трансгенез - искусственный перенос гена или группы генов из одного организма в другой и создание условий для его/их экспресии (т.е. выражения: транскрипции, трансляции, приводящих к появлению в клетках организма-реципиента биологически активного генного продукта).
Основой для развития исследовательских работ по межвидовому транспорту генов послужили серьезные достижения последних десяти лет в области генной инженерии - т. е. технологии манипулирования с рекомбинантной ДНК. Методологически, работы по созданию трансгенных организмов можно разделить на несколько этапов: выделение или исскуственный синтез нужного гена, встраивание этого гена в другую молекулу ДНК (вектор), способную к автономному существованию в клетке и обеспечивающую систему экспрессии гена в чужеродном окружении, введение вектора носителя гена в организм - реципиент, отбор клеток или особей - носителей данного гена.

На начальном этапе развития исследовательских работ по трансгенезу у эукариотических организмов одной из основных проблем являлся поиск и конструирование векторов-носителей для переброски полезных генов. Сейчас эта проблема в значительной степени решена, что дало серьезный импульс распространению трансгенных манипуляций с растениями и животными. В отношении растений наиболее используемыми векторами - носителями являются Ti (tumor inducing) и Ri (root-inducing) плазмиды, выделенные из бактерий, способных образовывать с высшими растениями сложные симбиотические ассоциации. Ti плазмиды содержат в составе своей ДНК так называемые T-участки (от английского transfer - перенос), способные встраиваться в ядерный геном некоторых растений. Встраивание в T-участок нужного гена превращает Ti-плазмиду в вектор - носитель для трансгенных манипуляций. Необходимо также отметить, что генная инженерия и трансгенез у растений могут затрагивать не только ядерный наследственный материал, но и ДНК хлоропластов и митохондрий. Так, в митохондриях кукурузы были обнаружены плазмиды S-1 и S-2, что открывает определенные возможности для введения туда чужеродных генов.

Для трансгенных работ с животными используют вектора, разработанные на основе ДНК вирусов (например, SV40, вируса бычьей папилломы и т.д.). Перенос таким способом полезных генов оказался возможен после ослабления путем генно-инженерных манипуляций патогенности вируса для клеток организма-реципиента. Весьма полезными качествами вирусных векторов-носителей является способность многих из них встраиваться в ДНК клетки хозяина, а также легко проникать в клетку путем обычной инфекции.

Таким образом, трансгенез позволяет наделять уже существующие сорта с/х растений и породы животных новыми, важными с практической точки зрения признаками. Эти возможности обусловили его широкое распространение в современной биотехнологии (см. разделы Трансгенные растения, Трансгенные животные). В то же время, существует ряд нерешенных проблем, сдерживающих дальнейшее интенсивное развитие трансгенеза. Прежде всего это проблема тканеспецифицеской экспрессии (выражения) гена (т.е. генный продукт должен образовываться не во всех клетках организма - реципиента, а только в некоторых), а также перекликающаяся с ней проблема замолкания (т.е. прекращение экспрессии) чужеродного гена. Рядом с непосредственно трансгенными исследованиями находятся и задачи поиска новых генов, ответственных у животных и растений за наличия ценных признаков. Решение данных задач включает определение нуклеотидной последовательности и составление генетических и физических карт геномов различных организмов

Показано, что изолированные метафазные хромосомы проникают в чужеродную клетку и их гены функционируют в этой клетке. Такая трансформация облегчается при заключении хромосом в фосфолипидную оболочку (линохромосомы). В таких условиях снижается частота деградации хромосом при их переходе в чужую клетку. Величина трансформации по отдельным маркерным генам достигает 10.

Метафазные хромосомы поглощаются клетками путем пиноцетоза. Большая, часть поглощенных хромосом деградирует, распадаясь на отдельные фрагменты. За счет этих фрагментов осуществляется перенос содержащихся в них генов. Фрагменты могут существовать в свободном состоянии. Размер фрагментов, называемых трансгеномами, как показали цитологический и гибридизационный анализы, не превышает 1% гаплоидного набора клетки донора. Гены трансгенома функционируют наряду с другими своими хромосомными генами клетки. Это функционирование может длиться в течение некоторого времени. Такие клоны называют нестабильными. При постоянном действии генов трансгенома появляются стабильные клоны. В случае стабильной трансформации сохранившийся фрагмент интегрируется с хромосомой клетки реципиента. Интеграция происходит не путем рекомбинаций через двойной кроссинговер, а через транслоцирование фрагментов на негомологичные участки генома реципиента.

При введении хромосом от донора в реципиентную клетку можно использовать микроклетки. В этом случае клетки доноров обрабатываются таким образом, что часть хромосом или отдельные хромосомы оказываются заключенными в часть цитоплазмы. Слияние микроклетки донора с полноценной клеток реципиента ведет к тому, что реципиент получает группу или отдельные хромосомы донора.

ДНК человека с помощью ферментов нарезается на фрагменты. Эти фрагменты можно клонировать в клетках бактерий. Такие фрагменты используются для картирования хромосом и без знания функций данного гена в клетке.


Предыдущие материалы: Следующие материалы: